DAÑOS EN EL GENOMA HUMANO. PERCY ZAPATA MENDO.
DAÑOS EN EL GENOMA HUMANO
Las teorías que consideran el daño
molecular como origen de procesos degenerativos asociados al envejecimiento
(Harman, 1991) parecen explicar, en gran medida, muchos de los fenómenos
relacionados con este. Según dichas teorías cabe esperar que el deterioro en
las estructuras moleculares aumente con el tiempo, a pesar que las células
cuentan con dispositivos muy eficientes para contrarrestarlos a medida que son
detectados. Las manifestaciones fenotípicas de esas alteraciones serán más o
menos acentuadas en función de la cantidad y el tipo de moléculas afectadas. En
este sentido hay que pensar que los daños en biomoléculas (proteínas, lípidos,
etc.) tendrían, en principio, escasa repercusión si se producen a baja
frecuencia, ya que según el tipo de molécula dañada podrían ser reparada o
sintetizada una nueva copia de la misma. No ocurriría lo mismo si el daño se
produjese en determinadas regiones del genoma de células somáticas o germinales
(se incluyen en esta denominación genérica tanto células de tejidos
reproductivos como las células madre de tejidos adultos) que contengan genes o
regiones reguladoras de la expresión de los mismos, ya que en este caso, si el
daño permanece sin reparar podría verse afectada fenotípicamente la línea
celular en cuyo genoma se localice la alteración (Lombard et al.,
2005).
Dada la relativa facilidad con la que hoy
se puede amplificar y analizar una determinada región del genoma, no resulta
extraño que en los últimos años se hayan incrementado de manera considerable
los trabajos encaminados a la búsqueda de genes implicados en la etiología
molecular de numerosas enfermedades, y entre estas las que se asocian al
envejecimiento. En este sentido los casos más representativos tal vez sean los
tumores y determinados procesos degenerativos, debido al incremento de la
incidencia de los mismos en relación con la edad y su etiología mutacional. La
relación causal entre deterioro genómico y envejecimiento parece evidente
(Johnson et al, 1999), y tal
vez sea esta la faceta mejor estudiada a nivel molecular en lo que al
envejecimiento se refiere, por ello dedicamos este capítulo a exponer las
causas del deterioro del ADN celular y los mecanismos de que dispone la célula
para repararlo.
1.- Inestabilidad del material genético
Cuando a lo largo de la evolución la
naturaleza selecciona una determinada molécula para desempeñar una función
concreta, se supone que se trata del instrumento óptimo para ello, aunque en
algunos casos resulta difícil conjugar ciertas propiedades como eficiencia
funcional y estabilidad química, un ejemplo claro de esta dificultad la tenemos
en el caso de los ácidos nucleicos como portadores del mensaje genético. Las
bases nitrogenadas que forman parte del ADN son especies moleculares
relativamente inestables, y en el medio intracelular sufren, de manera espontánea
y con relativa frecuencia, modificaciones químicas (Watson et al.,
1987). La composición química de los nucleótidos también se puede ver
modificada por la acción de agentes externos (mutágenos) de naturaleza física o
química, aunque este tipo de alteraciones no serán tratadas en este trabajo,
hay que decir que muchas de ellas son detectadas y reparadas por los mismos
mecanismos celulares utilizados para el caso de las alteraciones espontáneas.
Otro posible origen de alteraciones espontaneas en el ADN radica en la gran
similitud estructural que presentan las diferentes bases entre sí (púricas o
pirimidínicas), esto hace que en algunas ocasiones la maquinaria encargada de
duplicar el material genético, a pesar de su elevada eficiencia en el proceso,
“confunda” las bases y origine una mutación. Aun así la precisión con que la
maquinaria replicativa lleva a cabo su función es muy alta, ya que además
dispone de un mecanismo de supervisión y corrección de la copia recién
sintetizada. Se calcula que la frecuencia con la que la maquinaria replicativa
coloca en el ADN sintetizado una base incorrecta es de aproximadamente una de
cada 10.000, cifra importante si tenemos en cuenta el número total de nucleótidos
que tiene un cromosoma eucariótico. No obstante el sistema de revisión de copia
de la polimerasa rebaja la frecuencia de errores unas 100.000 veces sobre la
anterior, por lo que podemos decir que la frecuencia de errores espontáneos
cometidos por la polimerasa nuclear encargada de replicar el ADN es de
aproximadamente un nucleótido de cada 109. Este no sería el caso de
la polimerasa del ADN mitocondrial, donde la eficiencia a la hora de corregir
errores es mucho más baja, lo que se traduce en una tasa mutacional más elevada
que la que se observa en el ADN nuclear.
De lo anteriormente expuesto se concluye que, según la fase del ciclo
celular que consideremos, hay dos tipos de mutaciones en función de su origen:
§
A) Las que se
producen sobre el ADN no replicante producto de alteraciones químicas
(espontáneas o inducidas por agentes internos o externos) en las bases
nitrogenadas.
§
B) Las que
se producen en la fase S, originadas por un error de la maquinaria replicativa.
Las mutaciones que más parecen afectar a la célula son aquellas que, no
habiendo sido previamente reparadas, obstruyen el proceso replicativo o la
transcripción genética, por ello los mecanismos de reparación más activos los
encontraremos actuando en las etapas del ciclo celular donde ocurran dichos
fenómenos. Se supone que el ADN presente en la cromatina de alto grado de
compactación (heterocromatina) no sería objeto de supervisión frecuente fuera
de la fase S del ciclo por dos razones:
§
A) El
recubrimiento proteico del ADN en la cromatina disminuiría la posibilidad de
que aquél se exponga a agentes mutagénicos, reduciéndose de esta forma la
frecuencia de mutación (en este caso el ADN mitocondrial, al carecer
prácticamente de histonas, estaría más expuesto a la acción de agentes
mutagénicos).
§
B) La alta
compactación de la cromatina impediría a la maquinaria de supervisión de la
copia acceder a la superficie del ADN para poder realizar su labor. No obstante
es mucho lo que queda por conocer a este respecto.
Aunque la mutabilidad de la copia del material genético podría considerarse
una circunstancia adversa para la célula y su descendencia, es esta “naturaleza
mutable” del material genético lo que ha permitido evolucionar a los seres
vivos por adaptación progresiva a las condiciones impuestas por un entorno
variable. En algunos casos la forma en la que se manifiesta una mutación es una
alteración morfológica o funcional. En otros casos su nivel de letalidad es tal
que nunca dará lugar a un sujeto viable. Aunque, en la mayoría de los casos,
las mutaciones puntuales no dejan una huella fenotípica (mutaciones
silenciosas), bien sea porque no tienen como consecuencia la modificación de la
secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen mutado, o porque
la sustitución de un aminoácido por otro no altera mucho la función de dicho
producto. En el ámbito de estudio en el que nos encontramos –la senescencia–
tenemos que hacer además una clara distinción entre aquellas mutaciones que
heredamos de los progenitores y las que adquirimos a lo largo de la vida, y que
mayoritariamente afectan a nuestras células somáticas. Entre las primeras
podría haber algunas que nos predispusiesen al envejecimiento prematuro
(disfunción acentuada de un tejido específico aún en fases tempranas de la
vida), y que darían lugar a una serie de patologías que se conocen con el
nombre genérico de “progerias” (precisamente en muchas de ellas están mutados
genes que defienden al organismo frente a las mutaciones). Las segundas se
irían adquiriendo de manera aleatoria a lo largo de la vida, en función de la
presión del ambiente, y su acumulación iría reduciendo progresivamente la
funcionalidad de los distintos órganos y tejidos hasta alterar la homeostasis
orgánica, de tal forma que a partir de cierto grado de deterioro haría inviable
el sistema produciéndose como consecuencia la muerte. Como vemos en esta última
definición va implícita la de envejecimiento.
2.- Modificaciones más frecuentes
en la copia del ADN
Sitios “AP”
Genéricamente se entiende por “sitio AP” un punto del genoma (ADN) que ha
sufrido la pérdida espontánea de la base nitrogenada; en este caso la base se
“desengancha” de la ribosa generándose un sitio (AP) “apurínico” o
“apirimidínico” (según la base que se pierda). Se calcula que en una célula
humana se generan al día unos 5.000 sitios AP. La polimerasa encuentra
dificultades para replicar una zona donde hay un sitio AP, por lo que la
alteración debería repararse antes de que la horquilla replicativa o la maquinaria
transcripcional alcance esa zona.
Desaminaciones
Otro tipo de alteraciones que sufre el ADN es la pérdida de grupos amino de
sus bases nitrogenadas (las que lo tienen: A, G o C). Hay que tener en cuenta
que la desaminación de una citosina produce uracilo, esta base no existe en el
ADN pero sí en el ARN, y por ello ha de ser sustituida nuevamente por una
citosina.
3.- Mecanismos de reparación del
ADN
Como acabamos de ver, la estabilidad de la
copia del material genético en un entorno celular considerado como normal está
muy comprometida, por lo que si no hay nada que se oponga a ello, el número de
mutaciones por célula y generación sería de tal calibre que la vida resultaría
difícil o imposible en tales circunstancias. Sin embargo, como ya se adelantó,
la célula ha adquirido a lo largo de la evolución toda una serie de mecanismos
que tienden a reducir el daño que se produce en el ADN (Wood, 1996). En
ocasiones estos actúan haciendo desaparecer el agente inductor del daño, como
es el caso de las enzimas antioxidantes: superóxido dismutasa (SOD), catalasa,
etc., neutralizando de esta forma especies reactivas del oxígeno, que de otra
forma podrían atacar el ADN, mientras que otros mecanismos (tal vez los más
variados) tratarían de reparar el daño producido en esta molécula. Las características
generales de estos sistemas de reparación aparecen comentadas en los siguientes
acápites:
– Ubicuidad: en todas las células.
–
Redundancia: varios sistemas por célula.
–
Complejidad: numerosos elementos intercambiables en la mayoría de los casos.
–
Eficiencia: nunca al 100% (unos más que otros).
–
Variabilidad funcional: un mismo sistema podría actuar de manera diferente en
cada tipo de célula.
–
Homología interespecífica: por lo general bien conservados evolutivamente.
La importancia que tiene el mantener una
copia “sana” del material genético para la célula, ha hecho que desde una etapa
muy temprana, los seres vivos desarrollasen toda una serie de estrategias para
reparar los daños que se producen de manera constante en el ADN. Los primeros
estudios que analizaron estos mecanismos se llevaron a cabo en procariotas, más
tarde el campo se amplió a eucariotas. En ambos casos se observó que dichos
mecanismos son redundantes, es decir que la célula no confía la supervisión y reparación
de su genoma a uno sólo de ellos, sino que dispone de varios que en muchos
casos interaccionan. Se calcula que una célula de mamífero dispone de al menos
130 genes involucrados en tales funciones, y no resultaría extraño que, a
medida que se conozca mejor el papel de los distintos genes humanos, aparezcan
nuevos loci relacionados con la reparación del ADN. Estos
datos, por sí solos, dan una idea de la importancia que para una célula tiene
el mantener su genoma sin defectos. Pero el aspecto más representativo de la
importancia de los mecanismos de reparación del ADN tal vez sea el gran número
de patologías cuya etiología se asocia a fallos en elementos moleculares en
dichos mecanismos.
En la mayoría de los casos, en estos mecanismos intervienen numerosos
componentes, por lo que su modo de acción no deja de ser complejo. En nuestro
caso presentaremos los más relevantes, y dentro de cada uno se presenta de
forma simplificada su mecanismo de acción:
REPARACIÓN DIRECTA
Por estos
mecanismos se reparan: metilación de guanina, y en algunos vertebrados dímeros
de pirimidina. No intervienen nucleasas ni ADN-polimerasas.
REPARACIÓN
INDIRECTA
Hay
intervención de nucleasas y ADN-polimerasas. Se necesita hebra “molde”
perteneciente al mismo cromosoma o al homólogo.
§
Escisión de base. Reparan casos de alteraciones puntuales
en bases nitrogenadas. Se origina un “sitio AP” y luego se retira el nucleótido
“AP” y se resintetiza la hebra.
§
Escisión de nucleótido. Reparan alteraciones
que distorsionan la conformación del dúplex y que obstaculizarían la
transcripción y replicación. Generalmente inducidos por bases alteradas o mal
apareadas. Una nucleasa escinde una porción de la hebra próxima al lugar del
daño. Inmediatamente se resintetiza una nueva siguiendo el molde
complementario.
§
Recombinación de regiones homólogas/ Unión de
fragmentos terminales de hebras rotas. Reparan lesiones en las que se ven
afectadas ambas hebras, o en las que no existe una hebra complementaria que
pueda actuar de molde fiable. Mecanismo más complejo que los anteriores.
La etapa más importante del proceso tal vez sea aquella en la que se
detecta el punto o puntos del genoma donde se localiza la alteración. Se cree
que una de las condiciones para que esto se pueda llevar a cabo es que la
molécula de ADN se encuentre descompactada, lo que permitiría al sistema
de detección “rastrear” dicha región en busca de errores, que se localizarían
por la distorsión estructural que un apareamiento de bases incorrecto produce
en el dúplex. En este sentido hay evidencias de que tanto la replicación como
la transcripción del ADN son etapas donde se lleva a cabo una intensa actividad
por parte de los sistemas de reparación.
Los sistemas de reparación indirecta intervienen sobre el ADN, en
replicación (fase S), transcripción o sobre hebras de ADN seccionadas. Como ya
se comentó anteriormente, la propia polimerasa del ADN, o algunos de los
componentes del mecanismo transcripcional, llevan a cabo la supervisión de la
copia recién sintetizada. En otros casos hay complejos moleculares que cooperan
con la polimerasa del ADN resolviendo casos en los que esta ha de replicar o
transcribir una determinada zona del genoma en la que se detecta una
alteración. A pesar de la gran cantidad de mecanismos y moléculas que
intervienen en estos procesos hay un denominador común en todos ellos, y es que
la mayoría están conservados evolutivamente.
Otros de los mecanismos que actuarían para preservar la integridad del
material genético serían aquellos que, en lugar de intervenir reparando la
copia del ADN, lo harían supervisando la integridad de los
desoxirribonucleótidos que serán utilizados para la síntesis del ADN, ya que
algunos derivados de estos pueden ser incorporados por la polimerasa en lugar
del d-ribonucleótido normal pudiendo dar lugar a una mutación, tal es el caso
del 8-hidroxi-dGTP.
3.1.- Mecanismos de reparación directa
Recuperación de guaninas metiladas
Una de las alteraciones que se
conocen en el ADN es el caso de la metilación de restos de guanina para formar
O6-metilguanina; en este caso la célula dispone de una enzima
“suicida” que localiza el lugar de la alteración y seguidamente transfiere el
grupo metilo desde la guanina a un resto de cisteína en su centro activo, la
enzima queda ahora inactivada, ya que este proceso no es reversible.
Reparación de dímeros de pirimidina
Un sistema similar actúa en
procariotas y en muchos eucariotas, en él interviene una enzima que detecta
dímeros de pirimidina que se producen en restos adyacentes C-C, C-T (siendo el
más frecuente T-T). En procariotas la enzima que repara esta alteración es la
fotoliasa. En primer lugar la enzima localiza el punto donde se ubica el dímero
y seguidamente se posiciona sobre él y repara la alteración.
Esta enzima además tiene una
interesante peculiaridad, y es que se activa por irradiación con longitudes de
onda visibles próximas al U.V. Aunque en algunos vertebrados se han detectado
enzimas que actúan de manera similar a la fotoliasa no se ha descrito todavía
para el caso del ser humano, donde este tipo de alteraciones se repara por
otros mecanismos. En este caso, los dímeros de pirimidina (que se supone un
tipo de lesión frecuente que produciría el envejecimiento de la piel) se pueden
reparar por otro mecanismo (escisión de nucleótido) que se describirá más
adelante.
3.2.- Mecanismos de reparación indirecta
En general estos mecanismos actúan
eliminando la base alterada utilizando diferentes estrategias:
Reparación por escisión de base
En este caso la base alterada es
retirada del ADN por un tipo de enzimas denominados glicosidasas. Hay varias y
cada una se ocupa de un tipo de modificación (Hipoxantina-ADN glicosidasa,
uracil-ADN -glicosidasa, etc.). Cuando estas retiran la base dañada se genera
un sitio AP (también se pueden generar sitios AP por otras causas), que
resultaría muy mutagénico si se dejase sin reparar, ya que bloquearía la
replicación o transcripción del ADN en ese punto, por lo que seguidamente
interviene una endonucleasa que retira el resto de ribosa fosfato del sitio AP,
dejando un hueco de un nucleótido que es rellenado inmediatamente por la acción
de una polimerasa del ADN, por último la hebra es sellada por la ligasa.
Reparación por escisión de nucleótido o
hebra
Este mecanismo de reparación es muy
similar al anterior, y de hecho comparte con aquél algunos de sus elementos
moleculares. En una primera etapa, el sistema reconoce el punto de la lesión.
Seguidamente actúa una endonucleasa que corta un pequeño fragmento de la hebra
que presenta la lesión a ambos lados de la misma dejando entre el nucleótido
afectado y ambos puntos de corte varios nucleótidos. Luego se retira esta
porción de la hebra al tiempo que una polimerasa de ADN comienza la síntesis
del fragmento que sustituirá al eliminado, tomando como molde la hebra “sana”.
Como en el caso anterior la ligasa
sellará la hebra nueva, dejando de esta forma reparada la alteración (en la
descripción de estos mecanismos, y para su simplificación, se omiten otras
proteínas que intervienen en el proceso, y que son también importantes para que
este se lleve a cabo). Son muchas las alteraciones que se reparan por este
mecanismo, entre ellas los dímeros de pirimidina, bases alteradas, etc. En
bacterias este sistema está muy bien estudiado y se parece mucho al que actúa
en levaduras (eucariotas unicelulares), aunque en estas últimas consta de más
elementos y es por ello más complejo. En mamíferos el sistema es similar al de
levaduras lo que demuestra que está evolutivamente bien conservado.
Mecanismos
de reparación por recombinación
Este mecanismo es complejo, y a
diferencia de los hasta ahora estudiados, utiliza una estrategia de
recombinación similar a la que opera en el intercambio de cromátidas que se da
en la meiosis, uniendo regiones homólogas de los cromosomas paternos y maternos.
El tipo de alteraciones que se reparan mediante este mecanismo suelen ser
aquellas que, por diferentes razones, no permiten disponer de hebra molde
(rotura de hebras, apareamientos anómalos entre bases, etc.). Este último tipo
de anomalía ha de ser reparada antes de que la zona sea replicada por la
polimerasa, ya que de no ser así se podría bloquear el proceso replicativo en
dicho punto o inducir una mutación permanente en la descendencia celular. Si
durante la fase S del ciclo celular, la polimerasa de ADN se encuentra una
alteración que no ha sido reparada anteriormente, puede ocurrir que introduzca
un nucleótido al azar con el consiguiente riesgo de mutación, o continúe su
labor dejando sin replicar la zona alterada hasta su reparación. En este último
caso la solución al problema consiste en retirar la porción de una de las
hebras no replicadas y seguidamente sintetizar una hebra nueva de ADN por un
mecanismo que toma como molde la hebra complementaria del cromosoma homólogo. Se
han descrito varias polimerasas del ADN que participan en la resolución de
problemas de este tipo. En general estas polimerasas no poseen la alta
fidelidad de copia de la polimerasa normal (la que replica el genoma en la fase
S del ciclo celular), por lo que cabe esperar una tasa de error incrementada
con respecto al que presenta esta última, y parece que cada una de ellas se
especializa en solucionar un tipo específico de alteración.
En general la fase S del ciclo
celular resulta crítica para la vida de la célula, ya que en ella el material
genético a replicar ha de estar en las mejores condiciones posibles antes de
ser transferida a la descendencia, de tal forma que si dicha copia está muy
dañada podría bloquear el proceso replicativo, hasta el punto de que la célula
opte por el “suicidio” (apoptosis) para evitar que pasen genes defectuosos a la
descendencia. El mismo sistema que regula la entrada en apoptosis alerta a los
mecanismos de reparación de errores en la copia del ADN celular a transcribir.
En caso de que este sistema falle podrían acumularse un número excesivo de
mutaciones en la célula. En este sistema de control participan numerosas
proteínas, aunque una de ellas, la denominada p53 juega un papel decisivo en el
mismo. Una prueba evidente de la importancia de esta proteína en el control del
ciclo celular la tenemos en el hecho de que una de las mutaciones más
frecuentes en tumores afecta a dicha proteína, este aspecto se tratará más en
detalle en el siguiente apartado.
El sistema de reparación por
recombinación homóloga se cree que es utilizado con frecuencia por la célula
para llevar a cabo la reparación de cromosomas rotos. Este tipo de lesión, como
ya se ha comentado, puede producirse por ataque de radicales hidroxilo sobre el
dúplex de ADN. De no repararse, la presencia de tales alteraciones provocará
graves daños a la célula, y su descendencia será con toda probabilidad inviable
debido a la pérdida de una cantidad importante de material genético. Por ello
la célula es particularmente sensible a este tipo de lesión, y para remediarlo
pone en marcha complejos mecanismos de reparación en los que intervienen un
elevado número de proteínas.
Además de esta estrategia de
reparación que se basa en la recombinación homóloga, se sabe que la célula
dispone de otra no menos sofisticada (aunque menos estudiada) para reparar el
mismo tipo de lesión. En este mecanismo la reparación de la rotura se produce
por empalme entre los extremos de los fragmentos del dúplex truncado (Barnes,
2001).
Un caso relevante en las
desaminaciones de las bases surge como consecuencia de la desaminación de la
5-metil-citosina, en este caso la retirada del grupo amino de la
5-metil-citosina convierte a esta en timina, que es un nucleótido normal en el
ADN, por lo que si este error no se repara antes de la replicación la
maquinaria encargada de la misma podría formar una hebra hija con una A en
lugar de una G. La importancia de este tipo de desaminaciones se debe a la
frecuencia con la que aparecen en el genoma eucariótico pares GC en los que la
citosina está metilada. Se piensa que la frecuencia de desaminaciones por
célula y día es más baja que la de formación de sitios AP, pero no por ello
dejan de ser una causa importante de mutaciones.
Tanto los sitios AP como las
desaminaciones son consecuencia directa de la naturaleza inestable del
nucleótido, estas modificaciones están desencadenadas por variaciones en el
entorno fisico-químico de la molécula que suponen cambios de pH o de
temperatura, cuando estos se apartan de los valores fisiológicos normales.
Metilaciones
En algunos casos se producen en el
ADN metilaciones, que consisten en la introducción de grupos metilo (–CH3)
en un átomo de la base nitrogenada. La metilación de bases nitrogenadas del ADN
es un fenómeno habitual tanto en procariotas como en eucariotas, ya que dicha
modificación específica (como es el caso de la metilación de restos de citosina
en los pares CG en eucariotas) cumple una función en la célula. No obstante se
conocen metilaciones atípicas de las bases, como en el caso de la formación de
un derivado metilado de la guanina (O6-metil-guanina). Esta base
modificada puede generar una mutación post-replicativa si no es reparada a
tiempo, ya que aparea con la misma probabilidad C y T.
INESTABILIDAD
QUÍMICA PROPIA DEL ADN
Pérdida de
base, metilaciones, desaminaciones, etc.
|
SUBPRODUCTOS
DEL METABOLISMO CELULAR
Radicales
libres y otros oxidantes.
|
AGENTES
EXTERNOS
Radiaciones
U.V., radiaciones ionizantes, agentes genotóxicos.
|
ERRORES DE LA
MÁQUINA REPLICATIVA
Colocación
defectuosa de bases en la replicación del ADN.
|
Dímeros de pirimidina
Este tipo de alteración es frecuente
encontrarla en células de la epidermis, y se caracteriza por la formación de un
enlace covalente entre dos bases pirimidínicas colocadas en posiciones
adyacentes en el ADN. Suelen formarse cuando el ADN se expone a una fuente de
radiación U.V.
La formación de un enlace entre ambas
bases distorsiona la doble hebra de tal forma que compromete la replicación o
la transcripción, por lo que han de ser reparados antes de que estas concluyan.
El hecho de que solamente se vea afectado tejido epidérmico se debe a que la
capacidad de penetración de la radiación U.V. no va más allá de unos
milímetros.
Daño oxidativo en el
ADN y rotura de hebras
Otro tipo de daños, no poco
frecuentes en el material genético, son las reacciones químicas que se producen
entre componentes del ADN y agentes químicos muy activos producidos por la
propia actividad celular (Halliwell y Gutteridge, 1999; Hasty y Vijg, 2002). En
este sentido las especies reactivas del oxígeno (RLO) –que hemos descrito en el
capítulo anterior– serían los ejemplos más representativos de dichas
sustancias. La interacción de los OH con el ADN deja toda una serie de
“huellas químicas” donde la más característica es la 8-oxo-2’ deoxiguanina
(Zglinicki et al., 2001), por lo que resulta relativamente fácil
cuantificar el daño evaluando la presencia de ese compuesto. Además de esto,
los radicales OH. actúan como fuertes oxidantes capaces de
reaccionar no sólo con las bases nitrogenadas, sino que pueden hacerlo, aunque
en menor grado, con otros elementos moleculares del dúplex, pudiendo provocar
con ello la rotura de una o ambas hebras del ADN (Barnes, 2002), lo que supone
un daño considerable en el genoma. Se estima que el número de ataques de
especies reactivas del oxígeno sobre el ADN por célula y día es de
aproximadamente 100.000 en el ratón y de unos 10.000 en humanos. Llegado este
punto hay que hacer una matización de interés, y esta se refiere al hecho de
que la única especie reactiva del oxígeno que parece que es capaz de atacar
diferentes componentes moleculares del ADN (azúcar o base nitrogenada) es el
radical OH.. Como ya se comentó anteriormente, la presencia de este
radical en el entorno del ADN en elevadas concentraciones, puede provocar la
rotura de la doble hebra. Esto es lo que ocurre en el caso de que radiaciones
ionizantes incidan sobre el ADN, ya que estas generan radical hidroxilo a
partir del agua presente en el organismo. Se descarta, al menos en condiciones
normales, que tanto el radical O2.-como H2O2 y NO. dañen
directamente al ADN, sino que lo harían previa generación de radical hidroxilo
(muy probablemente por reacción de Fenton en el caso del H2O2). Teniendo
en cuenta que la mayoría de derivados oxidantes del oxígeno se producen en la
mitocondria, y dada la alta susceptibilidad de su ADN a la mutación por
diferentes razones (falta de histonas, falta de mecanismos reparadores
eficientes, etc.), no es extraño que la tasa de mutaciones en el genoma
mitocondrial sea considerable.
Los experimentos in vitro realizados
con células eucarióticas tratadas con H2O2 han
demostrado que las mutaciones producidas por este agente químico se tratan de
deleciones y sustituciones de bases. Además, la distribución de estas
mutaciones no parece que sea aleatoria, ya que hay zonas del genoma que parecen
ser más susceptibles que otras. En principio no hay una explicación razonable a
este comportamiento, pero podría estar relacionado con el grado de compactación
de la cromatina en la zona mutada o la interacción de dichas regiones con
metales de transición implicados en la reacción de Fenton y que generarían
radicales OH. a partir de H2O2.
4.- Reparación del ADN y enfermedad
Las deficiencias en los sistemas de mantenimiento de la integridad del
genoma pueden acarrear desórdenes genéticos debilitantes, envejecimiento
prematuro, predisposición al cáncer y procesos degenerativos (Shiloh y Lehmann,
2004).
Con toda probabilidad la etapa más importante en el proceso de reparación
de los daños inducidos al ADN, es la del reconocimiento de la lesión (Kolodner,
2000). En general las lesiones que se reparan con mayor rapidez son aquellas
que se localizan en regiones donde el ADN está menos compactado, “más abierto”,
esto es, donde se replica o donde ha de transcribirse (hay factores de
transcripción que intervienen en mecanismos de reparación del ADN “abierto a
transcripción”). Esto tiene su sentido pues ambas funciones son imprescindibles
para la vida de la célula y requieren de una copia de ADN en buen estado. Por
otra parte las lesiones localizadas en zonas silenciadas (heterocromatina) del
genoma no tendrían en principio repercusiones fenotípicas al no expresarse los
genes contenidos en ellas.
Cuando una célula no puede replicar o transcribir un ADN por el grado de
deterioro de la copia, se para temporalmente el ciclo celular, con el fin de
dar tiempo a la maquinaria de reparación a que desarrolle su tarea. Cuando la
situación es crítica –debida al grado de deterioro del ADN– la célula entra en
apoptosis, abortando con ello el ciclo celular, y retirando del sistema la
línea celular cuyo genoma se encuentra dañado. Hay proteínas que
detectan alteraciones del dúplex o roturas cromosómicas en el tránsito G1–S
y activan un complejo mecanismo para repararlas, tal es el caso de las
proteínas BRCA, que de alguna forma detectan la presencia de errores en el ADN
(interviene en reparaciones de rotura de hebras; las mutaciones en los genes
que codifican para estas proteínas predisponen al cáncer de mama y otros
tumores) y activa la expresión de p53. Esta proteína (p53) es un factor de
transcripción que pone en marcha un mecanismo complejo, que tiene como
finalidad el retener el ciclo celular en G1-S mientras se reparan
los errores. La proteína p53 regula además la entrada de la célula en apoptosis
en el caso de que los daños inducidos al ADN no sean reparados. Se
sabe que una proteína denominada ATM (la proteína alterada en la
ataxia telangiectasia) se activa cuando el ADN está dañado, y se cree que
interviene en la activación de p53.
No obstante los niveles celulares de p53 han de estar bajo estricto
control, ya que la hiperexpresión de p53 puede inducir senescencia por
retención del ciclo celular o apoptosis, mientras que su carencia, o un defecto
en su funcionamiento, permite el paso de numerosas alteraciones genéticas a la
descendencia, en estas condiciones aumentan considerablemente el riesgo de
transformación tumoral. La relación causa-efecto entre la presencia de
genotóxicos y p53 queda patente por el hecho de que los niveles intracelulares
de p53 aumentan después de someter a la célula a radiaciones ionizantes o U.V.,
lo que hace pensar que el estímulo para su síntesis es el incremento del daño
al ADN inducido por los RLO que se producen al incidir las radiaciones en el
medio celular.
En el caso de que el sistema que regula la entrada en apoptosis no
funcione, la célula continúa su ciclo celular independientemente de las
lesiones que lleve el genoma, en este caso lo más probable es que esta línea
celular acumule con el tiempo una combinación de mutaciones que la
conducirán a una incapacidad metabólica o a una transformación maligna, de ahí
que la patología que más frecuentemente se asocie al envejecimiento sea el
cáncer (Ames,1993; Hoeijmakers, 2001; Klaunig y Kamendulis, 2003).
Enfermedades hereditarias y
defectos en la reparación del ADN.
–
Xeroderma Pigmentosum.
– Cáncer.
– Ataxia
telangiectasia.
–
Síndrome de Bloom.
–
Síndrome de Cockaine.
–
Síndrome de Werner.
La manifestación más drástica de la importancia que tienen los sistemas de
reparación son las patologías asociadas a defectos en locus cuyos productos
están involucrados en dichos sistemas, algunos ejemplos serían: el Xeroderma
pigmentoso (Wood, 1999) (donde hay, al menos, siete loci diferentes
cuya mutación independiente produce la enfermedad), ciertos tipos de cáncer,
síndrome de Bloom, síndrome de Werner, síndrome de Cokcayne, tricotiodistrofia,
etc.
Sin lugar a dudas el cáncer es una enfermedad de nuestros genes, aunque
bajo esta denominación genérica se agrupan diferentes etiologías moleculares.
El aumento de la frecuencia de aparición de cáncer con la edad se asocia al
aumento de daños en el material genético también con la edad. Estos daños,
además de a otros loci, afectarían fundamentalmente a oncogenes y genes
supresores de tumores, activando los primeros y silenciando los segundos, en
muchos de estos casos hay que decir que no existe mutación en el sentido
estricto del concepto (no hay alteración de la secuencia de bases en el ADN),
sino más bien un fenómeno epigenético.
Lo que llama la atención en los sistemas de reparación de daños en el ADN
es que un determinado defecto de un mecanismo de reparación no afecta de la
misma forma a todas las células. En algunas ocasiones se produce enfermedad aún
a pesar de que la maquinaria de reparación está intacta. En este caso la
alteración afecta a genes encargados de regular la respuesta al daño en el
genoma, por lo que no funcionaría el sistema de alerta o detección ante una
anomalía. En este grupo podemos incluir a la ya citada proteína p53, cuyo gen
aparece mutado en numerosos procesos tumorales.
La anemia de Fanconi es otra enfermedad relacionada con la reparación del
material genético (puede estar producida por la alteración de varios loci
diferentes), en este caso lo que se cree que falla es el sistema de detección o
respuesta al daño en el ADN, ya que los individuos que la padecen parecen tener
los sistemas de reparación intactos.
5.- Telémeros y senescencia replicativa
A mediados del siglo pasado
(1961) Hayflick and Moorehead observaron que fibroblastos y otras células
humanas no tumorales en cultivo eran capaces de llevar a cabo un número finito
de duplicaciones. Llegado este momento las células perdían su potencial
replicativo y entraban en una fase de “senescencia replicativa”. Dicho estado
no supone la muerte inmediata de la célula, más bien sería una situación
similar a una fase G0 del ciclo celular. El número de
duplicaciones que es capaz de realizar una determinada célula en cultivo es más
o menos constante (siempre que las condiciones del cultivo no se modifiquen) y
se conoce como límite de Hayflick. Hoy sabemos que este fenómeno se debe, en
gran medida, a la pérdida de parte del material genético no codificante
localizado en la región terminal de los cromosomas, que se conocen con el
nombre de telómeros. Algunas evidencias experimentales ponen de manifiesto una
posible relación entre longitud de telómeros y envejecimiento in vivo (Smith
y Pereira-Smith, 1996).
Los telómeros son
regiones terminales de los cromosomas lineales, en las células humanas se
componen de secuencias cortas altamente repetitivas colocadas una a
continuación de otra (en tandem) con tamaños de hasta 15.000 pares de bases. En
humanos la secuencia que se repite es: TTAGGG. En los telómeros no se han
identificado, hasta el momento, secuencias codificantes (con genes), pero se
sabe que son fundamentales para proteger los extremos de los cromosomas de
ataques enzimáticos (exonucleasas celulares) o modificaciones químicas
(producidas entre otros por radicales libres). En este sentido los telómeros
actuarían de secuencias protectoras, minimizando cualquier posible alteración
sobre los extremos de los cromosomas. Además, durante la mayor parte del ciclo
celular el ADN telomérico se encuentra altamente compactado constituyendo parte
de la heterocromatina. En la estructuración de esta cromatina intervienen
–además del ADN– proteínas que se asocian a éste y se cree que lo protegen de
posibles alteraciones causadas por agentes mutagénicos.
Telomerasa y mantenimiento de los telómeros
En cada ciclo de división se pierden en cada telómero
una media de 30-200 pares de bases debido al mecanismo de polimerización utilizado
por la polimerasa, por esta razón se considera a los telómeros como posibles
“relojes replicativos” que limitarían el número de duplicaciones que una célula
puede llevar a cabo. Una vez rebasado un cierto número de replicaciones,
durante las que los telómeros se habrían ido acortando por el propio mecanismo
replicativo, se empezarían a perder genes situados en las regiones adyacentes a
los telómeros.
§ A. La ADN
polimerasa no puede replicar la hebra retardada por no encontrar un molde
complementario en el punto de inicio, si la replicación terminase en estas
condiciones la parte de cadena de ADN que no forma dúplex sería degradada
perdiéndose esa parte del telómero.
§ B. La
telomerasa sintetiza fragmentos de hebra molde aumentando su longitud hasta el
punto en el que la polimerasa pueda iniciar una nueva replicativa.
§ C-D. La
polimerasa inicia la síntesis de la hebra retardada a partir de un cebador y
tomando como molde la hebra de síntesis directa previamente elongada por la
telomerasa. Posteriormente la ligasa sellará la mella dejada por la polimerasa
y se concluirá la síntesis de la hebra retardada.
La situación representada se refiere a la etapa final
de la síntesis de un telómero, en ausencia de la telomerasa se perderían los
fragmentos monocatenarios no replicados (la porción que está sobre la línea
discontinua) cada vez que la célula salga de una fase S de su ciclo.
Dependiendo del número e importancia de los genes
dañados por este mecanismo se vería afectada la viabilidad de la célula. No
obstante, en líneas celulares destinadas al mantenimiento de estirpes celulares
más diferenciadas (células germinales de tejidos reproductivos y no
reporductivos), así como en líneas celulares inmortales (como las tumorales),
el acortamiento telomérico es inexistente o está minimizado. Esta circunstancia
se explica por la presencia de una ribozima (enzima con parte proteica y parte
de ácido ribonucleico), con funciones de transcriptasa inversa llamada
telomerasa, que actuaría de manera coordinada con la polimerasa del ADN,
evitándose de esta forma la pérdida de material cromosomómico al final de cada
ciclo replicativo (para comprender mejor la dinámica del fenómeno visitar la
página: http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Telomerase.html).
La telomerasa está compuesta por una parte proteica y
por una corta cadena de RNA, complementaria de la secuencia que se repite en los
telómeros de los cromosomas de la célula que la produce. Los genes humanos que
codifican tanto para la fracción proteica de la polimerasa, como para el
pequeño fragmento de ARN se expresan activamente en células germinales, pero
están silenciados o casi inactivos en la mayoría de las células diferenciadas.
No obstante estos genes reactivan su expresión en la mayoría de las células
cancerosas, donde la acción de la telomerasa es necesaria para sostener la alta
tasa replicativa característica de las células que forman un tumor.
La relación entre telomerasa y senescencia replicativa
se pudo comprobar in vitro al inmortalizar fibroblastos
transfectados con los genes que codifican para la síntesis de la telomerasa. No
obstante la relación causal entre telomerasa y envejecimiento está aún lejos de
demostrarse de forma evidente, los ensayos diseñados al respecto han dado
resultados contradictorios, además parece que la contribución real de la
telomerasa in vivo al mantenimiento de los telómeros no parece
ser tan evidente como se pensaba.
Los telómeros son muy sensibles a la presencia de
radicales libres (Raha y Robinson, 2000; Eppel, 2004), los estudios encaminados
a establecer la relación entre daño telomérico y estrés oxidativo ponen de
manifiesto una clara relación causa efecto, observándose notables acortamientos
teloméricos en células cultivadas en condiciones en las que aumenta la
concentración intracelular neta de radicales del oxígeno. La forma en la que el
ataque por radicales libres produce el acortamiento telomérico no se conoce con
exactitud, pero podrían estar involucradas alteraciones tales como rotura de
hebras y otras modificaciones químicas en nucleótidos situados en el extremo
del cromosoma.
Finalmente
De todo lo anteriormente expuesto podemos concluir que, en mayor o menor
medida, el envejecimiento de un organismo es debido a la senescencia o muerte
de parte de sus células provocado por un deficiente mantenimiento de la copia
del genoma.
La permanente agresión a la que se ve sometida la copia del ADN en las
células de los diferentes tejidos a lo largo de la vida del individuo, genera
una inestabilidad del genoma que se manifiesta en forma de mutaciones que
provocan: productos deficientes, bloqueo de la transcripción o de la
replicación, etc. Estas circunstancias son interpretadas por la célula como una
situación de estrés al cual ha de responder de manera eficiente, si no quiere
ver comprometida su viabilidad o funcionalidad, y por ello determina en gran
medida el ritmo al que una célula envejece, ya que en él influyen dos elementos
contrapuestos:
§
A) La
frecuencia con la que se producen daños en el genoma.
§
B) La
rapidez y eficiencia con que los mismos son detectados y reparados por la
célula. Según esta hipótesis, aquellos individuos con una tara genética en la
que se vean afectados loci que codifiquen para productos
relacionados con sistema de reparación del ADN, serían más susceptibles de
presentar un envejecimiento prematuro.
En el plano experimental parece evidente
la relación causa-efecto entre alteraciones genéticas que afectan a mecanismos
de reparación del ADN y enfermedades asociadas al envejecimiento, tales como
cáncer o síndromes progeroides. Por ello se espera que el estudio de dichos
mecanismos nos permitirá determinar el impacto fenotípico de los daños
acumulados a lo largo del tiempo en el genoma, y además contribuirá a
establecer nuevas estrategias de prevención, determinación de susceptibilidad
genética, diagnóstico y terapia racional.
En lo referente al papel biológico de la
telomerasa su función como agente estabilizador de las regiones teloméricas
parece claro. No obstante el mantenimiento de la integridad de los telómeros es
complejo y en él intervienen otros muchos elementos además de la telomerasa.
Dada la complejidad de este fenómeno, no podemos considerarlo como el único
regulador de la senescencia replicativa. No hay que olvidar tampoco que la
telomerasa juega un papel importante en el mantenimiento de la inmortalidad de
las células cancerosas.
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